Haluan aloittaa muistutuksella, joka usein unohtuu julkisissa keskusteluissa: Covid-mRNA-rokotteet ovat aidosti uusia lääketuotteita.
Ennen vuoden 2020 hätälupia mRNA-rokoteteknologiaa ei ollut koskaan käytetty laajamittaisesti ihmisillä. Vain kaksi kliinistä tutkimusta, toinen Pfizer-BioNTechin ja toinen Modernan, olivat koskaan testanneet tätä alustaa ihmisillä. Yhteensä noin 37 000 henkilöä oli koskaan saanut mRNA-rokotteen lääketieteen historiassa (ei sisällä aiempia kokemuksia rabies-, CMV- ja syöpärokotteista, jotka rajoittuivat paljon pienempiin varhaisen vaiheen tutkimuksiin). Tämä ei ole kritiikkiä; se on yksinkertaisesti tosiasia. Mutta se tarkoittaa, että näiden tuotteiden pitkän aikavälin turvallisuusprofiilia ei ymmärretty ja ymmärretä edelleen puutteellisesti.
Seuraava on tuttua lähes kaikille molekyylibiologeille. Se on monimutkaista, mutta yritän yksinkertaistaa sitä ottaen huomioon panokset. On tärkeää selittää molekyylikehys selkeästi kaikille, koska rokotteiden valmistustapa määrää suoraan, mitä injektiopullo sisältää.. Ja injektiopullon sisältö, kun se on ruiskutettu, kulkeutuu koko kehoon ja käynnistää tapahtumaketjun, jolla voi olla pitkäaikaisia terveysvaikutuksia.
In vitro -transkriptio ei ole vain valmistukseen liittyvä yksityiskohta
Modifioituja mRNA-rokotteita tuotetaan in vitro -transkriptioksi kutsutulla prosessilla (IVT)IVT on menetelmä, jota käytetään syntetisoimaan modifioitua mRNA:ta, josta lopulta tulee rokotteen vaikuttava aine.
Tämä ei ole mikään triviaali tekninen yksityiskohta. IVT muokkaa perustavanlaatuisesti lopputuotteen molekyylikoostumusta.
BioNTechin tutkijat, mukaan lukien Pfizer-rokotteen kehittämiseen suoraan osallistuneet, ovat julkaisseet yksityiskohtaisen katsauksen1 ...kuvataan, kuinka IVT-reaktiot tuottavat paitsi aiotun täyspitkän mRNA:n, myös erilaisia sivutuotteita ja epäpuhtauksia, miten nämä tyypillisesti poistetaan ja mitkä niiden biologiset seuraukset voivat olla, jos ne pysyvät. Nämä valmistussuunnat ja niiden tuottamat sivutuotteet on myös kuvattu yksityiskohtaisesti Modernan patenteissa (US 10 653 712 B2 ja US 10 077 439 B2). Mutta mikä tärkeämpää, tämä molekyylibiologia oli vakiintunutta jo kauan ennen Covidia. Mikään tästä ei ole spekulatiivista.
Lähtömateriaali: DNA-mallit
Pohjimmiltaan IVT-reaktio alkaa kaksijuosteisesta DNA:sta, joka koodaa haluttua proteiinia. Tässä tapauksessa SARS-CoV-2-piikkiproteiinia.
mRNA-rokotteissa käytetty piikkiä koodaava sekvenssi on geenimuunneltu vakauden ja solujen toleranssin parantamiseksi, mukaan lukien kaksi aminohapposubstituutiota, jotka erottavat sen viruksen piikin vaikutuksesta. Tämä modifikaatio on tahallinen.
Itse DNA-templaatti voi olla eri muodoissa. Pfizerin varhaisissa kliinisissä kokeissa käytettiin PCR:llä tuotettuja DNA-fragmentteja. Kaupallinen valmistusprosessi kuitenkin perustui plasmideista peräisin olevaan DNA:han. Tällä on merkitystä, koska plasmidit sisältävät lisää säätelysekvenssejä. Pfizerin tapauksessa näihin kuuluvat elementit, kuten SV40-promoottori ja ori-sekvenssit, jotka herättävät huolta, jos ne pääsevät ihmissoluihin.
Kun tämä DNA-templaatti on lisätty IVT-reaktioon yhdessä RNA-polymeraasin ja muiden komponenttien kanssa, se transkriptoituu mRNA:ksi (kuva 1).
IVT tuottaa sivutuotteita suunnittelun avulla
Vaikka IVT:n haluttu tuotos on tarkoitettu täyspitkä mRNA-tuote, varsinainen tuotos on monimutkaisempi. Näihin kuuluu erilaisia sivutuotteita (1) erilaisten RNA-lajien, kuten kaksijuosteisen RNA:n (dsRNA), (2) RNA:han kiinnittyneen DNA:n (RNA-DNA-hybridit) ja (3) alkuperäisestä templaatista peräisin olevan vapaan DNA:n muodossa (kuva 2).
Näiden sivutuotteiden muodostuminen on hyvin dokumentoitua ja väistämätöntä, ja siksi jatkopuhdistus on ehdottoman tärkeää turvallisuuden takaamiseksi.
Kuva 2. IVT-valmistuksen sivutuotteet ja epäpuhtaudet. Kuva mukautettu lähteestä 1.
Puhdistuksella on tunnettuja rajoituksia
Valmistuksen jälkeen tarvitaan kaksi puhdistusvaihetta: ensin DNA ja sitten RNA-sivutuotteet poistetaan (kuva 3):
Kuva 3. IVT-sivutuotteiden poisto. Kuva mukautettu lähteestä 2.
DNA:n poistamiseksi reaktioseokseen lisätään entsyymi nimeltä DNase I, jota käytetään yleisesti kontaminoivan DNA:n hajottamiseen. Vaikka DNase I tehoaa vapaaseen templaatti-DNA:han, useat tutkimukset, mukaan lukien BioNTechin tutkijoiden omat tutkimukset, osoittavat, että DNase I on tehoton RNA:han kiinnittyneen DNA:n (RNA-DNA-hybridit) poistamisessa.
Tämä rajoitus ei ole kiistanalainen. Se on dokumentoitu kirjallisuudessa.
Mitä riippumattomat analyysit ovat osoittaneet
Tämä konteksti on ratkaisevan tärkeä tulkittaessa valmiiden rokotepullojen viimeaikaisia riippumattomia analyysejä.
Tutkijat3 ja sääntelijät4 ovat raportoineet havainneensa DNA-kontaminaatteja käytännössä jokaisessa testatussa injektiopullossa. Näihin kontaminantteihin kuului sekä kaksijuosteista DNA:ta että RNA-DNA-hybridejä, jotka näyttivät olevan resistenttejä DNase I -sulatukselle.
Joissakin näytteissä piikkiä koodaavaa DNA:ta oli yli 100 kertaa enemmän kuin muissa plasmidisekvensseissä5, mikä viittaa epätasaiseen tai epätäydelliseen pilkkoutumiseen. Sekvensointi ja kvantitatiiviset PCR-analyysit havaitsivat edelleen keskimäärin noin 200 emäsparin pituisia DNA-fragmentteja, joista osa oli yli 4 kiloemästä. Useissa tapauksissa havaittiin lähes koko plasmidin kattavia sekvenssejä.
Yhdessä nämä löydökset herättävät vakavia kysymyksiä puhdistuksen johdonmukaisuudesta ja täydellisyydestä laajamittaisen valmistuksen aikana sekä jäännösnukleiinihappojen mahdollisista biologisista seurauksista ihmisillä.
Miksi nukleiinihappokontaminanteilla on biologista merkitystä
RNA ja DNA ovat synnynnäisten immuunireittien voimakkaita aktivaattoreita. Tämä ei ole spekulaatiota. Kuviontunnistusreseptorit ja cGAS-STING-reitti reagoivat voimakkaasti vieraisiin nukleiinihappoihin, laukaisten tulehduksen, kasvun estymisen ja jopa solukuoleman.
Juuri näiden mekanismien vuoksi geeniterapiatuotteet ovat tiukan turvallisuusvalvonnan alaisia.
Ironista kyllä, Covid-mRNA-rokotteet suunniteltiin modifikaatioilla, jotka oli erityisesti suunniteltu vähentämään tätä voimakasta synnynnäistä immuuniaktivaatiota. Mutta RNA-DNA-hybridit ja DNA-fragmentit aiheuttavat silti voimakkaita immuunivasteita näistä modifikaatioista huolimatta.
Sinnikkyys herättää uusia kysymyksiä
On nyt olemassa merkittäviä todisteita siitä, että piikki-mRNA ja -proteiini säilyvät ihmiskudoksissa viikkoja, kuukausia ja jopa vuosia rokotuksen jälkeen (taulukko 1).
Emme vielä tiedä, heijasteleeko tämä pysyvyys pitkittynyttä mRNA:n pysyvyyttä, jatkuvaa translaatiota vai DNA-pohjaisia mekanismeja. Mutta ottaen huomioon DNA:n integraation uskottavuuden ja pitkäikäisen integroitumattoman plasmidi-DNA:n lihassoluissa,6 Ei ole kohtuutonta olettaa, että Spike-mRNA:n, -proteiinin ja Spike-vasta-aineiden säilyminen vuosia rokotuksen jälkeen ei ole yhteydessä IVT:n jälkeisiin DNA-epäpuhtauksiin ja sivutuotteisiin.
Taulukko 1. Piikki-mRNA:n ja -proteiinin pysyvyys rokotuksen jälkeen ihmisillä
Lyhyen ja pitkän aikavälin turvallisuusvaikutukset
Yhdessä nämä tiedot herättävät useita tärkeitä turvallisuusnäkökohtia.
Ensinnäkin rokotuksen jälkeen on raportoitu akuutteja immuunireaktioita, kuten sytokiinimyrskyjä ja anafylaksiaa. Tällaisia voimakkaita tulehdusreaktioita ei pidä suoraan sivuuttaa epäpuhtauksiin liittyvinä, varsinkin kun otetaan huomioon, mitä nukleiinihappojen aiheuttamasta immuuniaktivaatiosta tiedetään.
Toiseksi, ja kriittisemmin, ovat pitkän aikavälin riskit. Jatkuva piikkien ilmentyminen voi uskottavasti myötävaikuttaa kroonisiin immuunioireyhtymiin. Vielä huolestuttavampaa on DNA:n integraation mahdollisuus, johon liittyy insertionaalisen mutageneesin tai geenien häiriintymisen riskejä. Tämä tarkoittaa syövän tai kehityshäiriöiden riskiä riippuen siitä, missä ja missä iässä DNA on integroitunut.
Merkittävää on, että FDA itse toteaa tiedotteissaan, että näitä rokotteita ei ole on arvioitu karsinogeenisuuden (syövän muodostuminen) tai genotoksisuuden (DNA-vauriot) varalta, mikä olisi rutiininomainen ja odotettava asia geeniterapian valvonnassa, jossa pitkäaikainen seuranta on vakiona.
mRNA-rokotteiden DNA:ta koskeva sääntelyaukko
Koska mRNA-rokotteiden jäännös-DNA:n esiintymisestä ei enää ole kiistaa, kysymys kuuluu, ovatko nykyiset ohjeet ja turvallisuusrajat asianmukaisia mRNA-rokotteille. Meille on vakuutettu, että DNA:n sivutuotteet ovat sääntelyohjeissa asetettujen rajojen sisällä. Mitä FDA sitten ohjeistaa DNA:n sivutuotteista ja kontaminanteista?
Yleisimmin siteerattu FDA:n ohjeistus jäännös-DNA:sta (≤10 ng annosta kohden) kehitettiin virusrokotteille, jotka on tuotettu elävissä soluissa, jotka ovat fragmentoituneita ja "paljaita", ja joilla on rajoitettu kyky päästä ihmissoluihin. mRNA-rokotteita ei kuitenkaan tuoteta soluissa, niiden jäännös-DNA ei ole isäntäsolusta peräisin, ja mikä tärkeintä, mRNA-rokotteiden DNA ei ole paljasta. Se liittyy LNP-jakelujärjestelmiin, jotka erityisesti tekevät DNA:n pääsyn solujen sisään erittäin helpoksi. FDA:n vuoden 2010 ohjeistus on selvä, ettei se aseta relevanttia turvallisuuskynnystä LNP-pohjaisiin tuotteisiin liittyvälle DNA:lle.
Toinen usein siteerattu ohjeistus on WHO:lta rekombinanttiproteiinihoitoja varten, jotka käsittelevät jäännös-DNA:ta tuotteissa, kuten monoklonaalisissa vasta-aineissa tai hormoneissa, jotka on tuotettu muunnetuissa soluissa. Tässäkin jäännös-DNA on peräisin isäntäsoluista tai ilmentämisplasmideista, esiintyy jälkinä, kapseloimattomana DNA:na (paljaana), ja lopputuote on puhdistettu proteiini, ei nukleiinihappopohjainen hoito (mRNA-rokote). Joten tämä ohjeistus ei koske mRNA-rokotteita.
Useimmin jäännös-DNA:n osalta mainittuja FDA:n tai WHO:n sääntelystandardeja ei käytetty kehitetty mRNA-rokotteita varten, eivätkä ne käsittele tätä turvallisuusongelmaa suoraan.
Mitä WHO sanoi mRNA-rokotteista – käyttöönoton jälkeen
Vuonna 2022 Maailman terveysjärjestö antoi ohjeistuksen, joka koski erityisesti mRNA-rokotteita.7Merkittävää on, että tämä asiakirja julkaistiin jälkeen näiden tuotteiden maailmanlaajuinen käyttöönotto. Siinä todetaan erityisesti, että tämä ohjeistus oli vastaus seuraaviin seikkoihin: ”tähän uuteen teknologiaan liittyvät turvallisuus-, tuotanto- ja sääntelykysymykset.Asiakirjassa on myös useita tärkeitä lausuntoja:
"Koska yksityiskohtaista tietoa tuotantomenetelmistä ei ole vielä saatavilla, turvallisia ja tehokkaita mRNA-rokotteita koskevia kontrolleja ei ole vielä standardoitu ja tietyt yksityiskohdat ovat edelleen omistusoikeudellisia eivätkä siten julkisesti saatavilla, ei ole tällä hetkellä mahdollista kehittää erityisiä kansainvälisiä ohjeita tai suosituksia."
Siinä todetaan edelleen: ”Yksityiskohtaiset tuotanto- ja valvontamenettelyt…tulee keskustella kansallisen sääntelyviranomaisen [NRA] kanssa ja hyväksyttää viranomaisen toimesta.] tapauskohtaisesti."
WHO myöntää, että mRNA-rokotteiden valvontaa ei ollut vielä standardoitu eikä erityisten kansainvälisten ohjeiden tai suositusten laatiminen ollut mahdollista. Lisäksi kansallisten viranomaisten suorittama tapauskohtainen arviointi edellyttää viranomaisvalvontaa.
Tämä todettiin sen jälkeen, kun mRNA-rokotteet oli otettu käyttöön..
Tämän Substackin kirjoitushetkellä FDA ei ole vieläkään laatinut standardoituja ohjeita mRNA-rokotteille eikä toimittanut mitään näyttöä tai turvallisuuteen perustuvaa tietoa, joka tukisi DNA:n rajoituksia mRNA-rokotteissa.
Lopuksi on syytä toistaa: vaikka mRNA-teknologia ei olekaan uusi asia, ennen Covidia sitä säänneltiin geeniterapiana, ei perinteisenä rokotteena. Covid-rokotteiden DNA-sivutuotteisiin liittyvät turvallisuusongelmat ovat samat minkä tahansa mRNA-rokotteen kohdalla, mukaan lukien influenssa-, RSV- tai jopa syöpärokotteiden mRNA-rokotteet.
Tämä johtuu siitä, että mRNA-tuotteet ovat perustavanlaatuisesti erilaisia. Niiden täytyy mennä soluihin ja ohjata niitä tuottamaan vierasta proteiinia. Tämä eroaa muista perinteisistä rokotteista, jotka toimittavat proteiinin suoraan. Tälle alustalle ei ole kliinistä ennakkotapausta, eikä toistuvalle annostelulle ole kliinistä ennakkotapausta. Eikä varmasti ennakkotapausta väestötasolla.
Tässä vaiheessa, kun pandemiaa ei ole, mekanistisia tietoja ja kliinisiä havaintoja kertyy ja markkinoille on tulossa yhä enemmän mRNA-rokotetuotteita, tarvitsemme läpinäkyvyyttä ja suoraa sitoutumista sääntelyviranomaisten vakaviin turvallisuustutkimuksiin, erityisesti FDA:n laatiessa kriittisiä ohjeita näiden tuotteiden valmistukselle – erityisesti DNA-sivutuotteiden osalta.
Uusi teknologia vaatii uudenlaista tarkastelua – ei hiljaisuutta, manipulointia tai sensuuria.
Viitteet
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S ym. Mol Pharm. 2022 4. huhtikuuta;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang ym. (2004) – ”Plasmidi-DNA:n integraation havaitseminen isännän genomiseen DNA:han lihaksensisäisen injektion ja elektroporaation jälkeen” (Gene Therapy, 2004). Hiirille injektoitiin paljasta plasmidi-DNA:ta lihaksensisäisesti, minkä jälkeen suoritettiin elektroporaatio oton tehostamiseksi. Käyttämällä erittäin herkkää PCR:ää puhdistetulla genomisella DNA:lla (geelierottelulla kromosomin ulkopuolisten muotojen poistamiseksi) kirjoittajat tunnistivat neljä toisistaan riippumatonta integraatiotapahtumaa neljä viikkoa injektion jälkeen. Liitosten sekvensointi vahvisti satunnaiset integraatiokohdat (ei ensisijaisia hotspot-kohtia), mikä on yhdenmukaista ei-homologisen päiden liittymisen kanssa. Integraatiotaajuus oli alhainen, mutta mitattavissa. Tämä on yksi selkeimmistä osoituksista todellisista spontaaneista integraatiotapahtumista in vivo paljaalla plasmidi-DNA:lla lihaksessa. On huomionarvoista, että tässä tutkimuksessa käytettiin tehostettua DNA:n kuljetusta elektroporaation avulla, jota voitiin verrata tehostettuun kuljetusta LNP-partikkelien kautta.
Martin ym. (1999) – ”Plasmidi-DNA-malariarokote: Genomisen integraation mahdollisuus lihaksensisäisen injektion jälkeen” (Human Gene Therapy). Tässä aikaisemmassa tutkimuksessa testattiin plasmidi-DNA:n IM-injektiota hiirillä ja käytettiin Southern blot -hybridisaatiota ja PCR:ää suurimolekyylipainoiselle genomiselle DNA:lle integraation tutkimiseksi. Vaikka pysyvyys oli enimmäkseen kromosomin ulkopuolista, he raportoivat todisteita harvinaisesta integraatiosta joissakin näytteissä (vaikkakaan ei yhtä lopullisesti sekvensoitu kuin myöhemmissä töissä). Se asetti vertailuarvon matalalle riskille, mutta tunnusti erittäin harvinaisten tapahtumien mahdollisuuden, mikä vaikutti FDA:n myöhempiin ohjeisiin DNA-rokotteista.
Ledwith ym. (2000) – ”Plasmidi-DNA-rokotteet: Tutkimus integroitumisesta isäntäsolun DNA:han lihaksensisäisen injektion jälkeen hiirillä” (Intervirology). Paljaalla plasmidi-DNA:lla, jota injektoitiin lihaksensisäisesti hiiriin, havaittiin integroitumista, ja vaikka havaittavaa integraatiota ei havaittu, DNA:ta havaittiin silti nelipäisessä reisilihaksessa 26 viikkoon asti. DNA oli kromosomin ulkopuolista.
7 WHO:n biologisen standardoinnin asiantuntijakomitean 74. raportti, liite 3. Lähetti-RNA-rokotteiden laadun, turvallisuuden ja tehokkuuden arviointi tartuntatautien ehkäisyssä: sääntelyyn liittyvät näkökohdat https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Tri Charlotte Kuperwasser on arvostettu professori Tuftsin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan kehitys-, molekyyli- ja kemiallisen biologian laitoksella sekä Tuftsin konvergenssilaboratorion johtaja. Tri Kuperwasser on kansainvälisesti tunnustettu asiantuntemuksestaan rintarauhasbiologiassa, rintasyövässä ja sen ehkäisyssä. Hän on rokotuskäytäntöjä käsittelevän neuvoa-antavan komitean jäsen.
Katso kaikki viestit
